比較GS環(huán)保試劑與常規(guī)試劑制備的組織樣本在熒光定量PCR中的效果

比較GS環(huán)保試劑與常規(guī)試劑制備的組織樣本

在熒光定量PCR中的效果

                                                   

張進華 肖莎  李顯箏  齊魯

南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系  廣州市珠江醫(yī)院病理科

 

摘自：2011年04期《診斷病理學(xué)雜志》

 

應(yīng)用GS生物組織標(biāo)本制備液（GS液）制作的石蠟切片提取DNA，進行實時熒光定量PCR技術(shù)擴增，并與常規(guī)方法制作的石蠟切片進行比較，結(jié)果沒有大的差別。證實GS液能較好地保存組織中的DNA。

1．材料與方法

1.1材料 取乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤組織各12塊，每種組織中6塊放入4%中性甲醛，6塊放入GS液，分別固定1、3、7、15、30和60天；用常規(guī)方法方法制成8μm厚石蠟切片。GS液包括環(huán)保型無醛固定液和脫水、透明、浸蠟液，由哈爾濱格林標(biāo)本技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1 DNA提取  對分別固定1天和60天的5種組織按下列方法提取：①每種組織切片5張，分別裝在2ml Ep管中加入1ml二甲苯，振蕩混勻10s，室溫全速離心2min，棄上清；加入1ml無水乙醇充分混勻，室溫全速離心2min，棄上清；打開Ep管蓋，37℃孵育10min，或至殘余乙醇全部揮發(fā)。②加入500μI TET溶液和30μI蛋白K，37℃水溶過夜。③加入500μI Tris飽和酚，充分振蕩，4℃ 13000r/min離心10min，取上清，加入250μI Tris飽和酚，250μI氯仿/異戊醇（24：1），輕輕翻轉(zhuǎn)10min，4℃13000r/min離心10min，取上清，并加入1ml預(yù)冷的無水乙醇及3moI/L，NaAc 30μI,充分混勻，-20℃過夜；4℃13000r/min離心15min，棄上清。向Ep管中加入75%乙醇1ml，輕輕翻轉(zhuǎn)3min，4℃13000r/min離心15min，棄上清；室溫干燥20min，加入50μI TE緩沖液溶解DNA（-20℃保存），取DNA測量OD值。計算OD260/OD280比值的DNA含量。

1.2.2 PCR反應(yīng)  用7700型實時熒光定量PCR儀擴增。向PCR反應(yīng)管中依次加入GS液與4%甲醛處理的5種組織提取的DNA模板100ng（約為105拷貝DNA）10μI建立如下反應(yīng)體系：Platinum SRBY  Green  qPCR SuperMix-UDG  25μI;正向引物10μMIμI；反向引物10μΜm1μI；不同模板選擇熒光素不同1μI/0.1μI；模板基因組DNA≤10μI；DEPC水補至50μI。PCR儀標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)程序；50℃2min，40個循環(huán)；95℃15s，60℃30s。

2．結(jié)果

標(biāo)記有SYBR熒光素與模板乳腺癌基因組DNA混合，標(biāo)記有vic熒光素與模板結(jié)腸癌基因組DNA混合，標(biāo)記有NED熒光素與模板肺癌基因組DNA混合，標(biāo)記有ROX熒光素與模板卵巢癌基因組DNA混合，標(biāo)記有CY5熒光素與模板淋巴瘤基因組DNA混合。完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤互補配對的探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在熒光激發(fā)波長470nm，熒光發(fā)射波長530nm，640nm、710nm、570nm、605nm定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)到20循環(huán)，被擴增的乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤基因DNA片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化的熒光信號強度轉(zhuǎn)化成線性圖譜（圖1，2）。

3．討論

本文主要探討用GS液固定1、3、7、15、30和60天的組織標(biāo)本中DNA的保存情況。若固定60天的標(biāo)本中能擴增出DNA，固定3、7、15和30天的組織標(biāo)本也應(yīng)該能擴增出DNA，所以3、7、15和30天沒有重復(fù)的意義，實驗僅取1天和60天比較。實驗結(jié)果顯示，GS液中的固定、脫水、透明試劑在病理組織標(biāo)本制作中，不但能增加對組織的軟化作用，而且滲透性強于甲醛，對組織固定的同時具有脫水、脫脂的兼容性。GS液PH值在6.5-7.0，微偏酸時對保存DNA效果良好。從實驗結(jié)果看，GS液固定與4%甲醛固定，制片沒有多大差異，完全可以滿足某些腫瘤分子生物學(xué)研究。該系列試劑對工作環(huán)境污染少，******了甲醛和二甲苯對人體的毒害作用，是值得大力推廣的新型環(huán)保試劑。

圖1  4%中性甲醛固定60天的乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌和淋巴瘤的線性圖譜（從左向右），其基線期、指數(shù)增長期、線性增長期和科臺期理論擴增成立。說明4%中性甲醛固定60天后仍能較好的保存模板基因  圖2 GS液固定60天的5種標(biāo)本，也能較了地保存模板基因，與4%中性甲醛固定60天的標(biāo)本大致相同。
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